基于C2C12细胞诱导分化形成自主性收缩肌管和不同分化阶段鉴定

小鼠胚胎肌母细胞C2C12 (ATCC, CRL-1772)细胞是肌肉相关研究领域的“明星工具”，在肌肉发育与组织再生、疾病机制、药物筛选等多个医学领域广泛应用。体外细胞实验中每一细节都可能直接影响实验结果，本文从细胞培养细节、分化诱导、肌管形态与功能以及分化阶段鉴定技术等几个方面进行了总结和分享。

 

一、细胞背景与培养特性

C2C12细胞是由D. Yaffe和O. Saxel建立的小鼠成肌细胞株的亚克隆，来源于2个月大的C3H小鼠大腿肌肉。这种细胞贴壁生长，细胞呈成纤维细胞样形态（图1），在高糖DMEM+10%血清培养体系下倍增时间约16小时，无血清培养体系下倍增时间约24小时，一般传代接种细胞密度每平方厘米不高于5000个细胞。 在常规高糖DMEM培养体系下C2C12细胞生长速度快，细胞密度在达到70%-80%时进行传代，细胞长得过满会降低成肌母细胞群体比例，影响后续的成肌分化。

图 1 C2C12细胞形态（SNB Lab）

 

二、成肌分化诱导过程

C2C12细胞的神奇之处在于其能分化成局部可伸缩有能肌管的能力，在细胞培养过程中聚合度达到约80%就会自动启动肌源性分化程序，此时换为低血清诱导培养基，生长因子（主要是血清中的促增殖因子）减少，细胞肌管分化会加速成熟，最终分化融合形成多核的有功能的肌管结构。在分化过程中涉及多个阶段和多种标志物在基因水平、蛋白水平表达变化，根据文献报道下表总结了不同分化时期特征、标志物和常见的检测方法。

 

三、分化验证技术方法

C2C12细胞肌管分化阶段验证技术方法多样化，在格宁生物实验室，我们不仅可以通过基因水平方法评价，还可以采用不同染色方法对分化肌管进行染色直观的定量分析，常用的染色方法有苏木-精伊红染色（HE）、细胞免疫荧光染色等。

 

1. HE染色

HE染色可较好地显示肌管的形态和肌管中的多核状态，苏木-精使细胞核呈蓝紫色，可以清晰呈现细胞融合的多核形态；伊红使细胞质呈淡红色，未分化细胞胞质蛋白浓度较低, 伊红着色较浅，已分化为肌管细胞胞质蛋白浓度较高，伊红着色较深，可以比较明显分辨分化程度差异，如图2。

图2  C2C12分化HE染色（SNB Lab）

2. 免疫荧光染色

在肌管分化免疫荧光染色中MHC在肌管中呈过量表达，并沿肌管长轴的纤维状结构呈绿色，细胞核在肌管内呈串珠状排列呈蓝色，如图3：

图3  肌管分化中晚期 MHC荧光染色结果（SNB lab）

可以极好地呈现肌管特征：多核融合（最显著特征），呈念珠状分布，细胞呈现厚实延长的管状结构并极性平行排列，利用高内涵Operetta CLS分析系统可以直观、精确地测量平均直径和长度，准确地以评估肌管的成熟度。

肌管分化成熟形成有功能的肌管结构，可以利用高内涵分析仪器DPC拍摄成熟肌管局部自主伸缩动态视频。

 

四、肌管功能检测

成功诱导C2C12细胞分化为肌管，需要结合形态学观察和分子标志物的检测进行综合判断。MyoD, Myogenin, Desmin 和 MyHC 是目前公认的、可靠的分化标志物。格宁生物实验室具有成熟稳定的基因水平、免疫荧光染色和数据分析等技术手段，可以直观、准确地验证分化效率和肌管的成熟度，为肌管相关研究奠定坚实的技术服务。