3D黑色素表皮模型--化妆品美白功效体外评估的可视化技术

东方女性以白为美，肤色白皙常常与青春貌美联系在一起，我国更是有“一白遮三丑”的俗语，因此美白功效产品一直是化妆品研发的热点。随着合成生物学蓬勃发展以及《化妆品注册备案管理办法》中对新原料的规定，对美白新原料的研发和功效验证变得更加炙手可热。在美白化妆品原料或产品研发阶段，通常会采用体外试验方法评估其美白功效，主要包括基于酪氨酸酶活性生化方法、2D单层黑色素细胞生物学方法，体外重建3D皮肤模型替代方法等，不同评估方法在原料/配方产品美白功效筛选的不同阶段发挥着不同作用，总体上，美白原料、配方产品功效筛选逻辑就像金字塔一样如图1，比如基于重建3D黑色素表皮模型筛选适用于已初步确认有一定美白作用的原料/配方产品筛选。

重建3D黑色素表皮模型以人源正常组织角质形成细胞和黑色素细胞为种子以一定的比例接种于特定生长环境中，经过浸没培养和气液培养增殖分化出类似于正常人表皮复层组织结构，模拟人使用化妆品场景多次涂抹于模型表面，可以从黑色素细胞功能、黑色素的合成以及向角质形成细胞的转运代谢等多个功效机制出发，通过实验技术获取基因水平、蛋白水平与组织水平等多维度功效数据，可以对待测样品进行综合全面的美白功效评估，比生物化学法和细胞生物学法更系统、更真实反应产品美白功效。

格宁生物（ScreeNingBio，SNB）实验室于2022年建立了基于体外重建3D黑色素表皮模型Skinovo® -Mela美白功效评估检测平台，采用模拟人涂抹化妆品使用场景将一定量待测物多次均匀涂抹于3D模型表面，主要检测指标包括黑色素相关基因表达、表观亮度（L值）、模型中黑色素含量，可视化指标包括表观色度、黑色素分布、模型中黑色素细胞数量、形态和酪氨酸酶活性等如表1。

针对每一个检测指标进行详细介绍：

国际照明委员会CIE建立的L*a*b*色度系统，在人体肤色分类、美白化妆品功效评价中得到了普遍认可和应用。其中L*表征表观亮度，其值越大，颜色越偏向白色，小则越偏向黑色。在美白功效评估数据中，表观亮度L数据可以原始数据呈现也可以以ΔL数据呈现如图2。

 

 经过待测物处理后黑色素表皮模型中黑色素含量的变化是衡量待测物美白功效的黄金标准。黑色素是化学结构及其复杂的一类大分子聚合物，一般采用强酸或强碱溶解进行绝对定量或相对定量图3,4，可以根据客户需求选择方法进行实验。

 

格宁生物实验室重点开发了基于3D皮肤模型研究美白功效的可视化技术，表观色度变化是其中一个可视化指标，待测样品处理后，把模型放在根据个体类型角（Individual Typological Angle，ITA°）绘制的色度卡如图5，是通过专业相机拍照观察不同处理组模型表面黑素沉积的变化，可以肉眼可见、直观地呈现待测物的美白效果如图6。

待测物经过皮肤模型表面涂抹并渗透到皮肤模型基底层到达黑色素细胞发挥其美白功效，是如何发挥美白功效、持续涂抹处理后3D表皮模型中黑色素细胞是什么状态、黑色素合成过程中关键限速酶酪氨酸酶活力怎么样、黑色素分布情况以及如何可视化呈现等等，这些问题一直是美白产品研发过程要解决的问题。

 

待测物处理后的黑色素表皮模型进行DOPA 染色和甲醛后固定后，显微镜水平拍照可以直观地呈现基底层的黑色素细胞状态以及待测样品处理后细胞差异如图7,8,9。基于DOPA染色结果，可以看出黑色素细胞呈现了正常的胞体形态表明待测物没有明显的毒性，与基质对照组相比，待测样品组黑色素细胞数量明显减少，黑色细胞形态多数呈梭形双极状，多极树突状细胞明显变少变短，限制了向周围角质细胞转运黑色素的能力。黑色素细胞胞体颜色明显比对照组白，证明酪氨酸酶合成黑色素的活力受到抑制。由此可见，利用3D皮肤模型基于黑色素细胞DOPA染色不仅可以直观地评价待测物的美白功效，还能从美白机制维度给出证据。

 

黑色素2D可视化分布采用Fontana-Masson(FM) 嗜银染色，利用黑色素具有将银氨溶液还原为金属银的特性即嗜银反应来显示黑色素，染色后黑色素呈黑色如图10，是目前常用的黑色素特殊染色的方法之一，将染色后的玻片扫描并用ImageJ分析黑色素面积，分析比较对照组和待测样品组差异，确定待测样品的美白功效。

 

另外，我们可以借助不同的显微镜技术扫描3D黑色素表皮模型不同厚度的黑色素，可视化地呈现黑色素的分布和数量变化如图11,12

重建3D黑色素表皮模型是一种持续生长的特殊生物检测工具，模型的组织结构、活细胞层数、角质层厚度随模型培养生长时间发生变化，对待测物的吸收渗透能力也随之发生改变，所以待测物表面涂抹的时间窗口（Time Window）对检测结果有很大影响。正常机体条件下黑色素表达水平不高，可以引入物理或化学诱导因素比如紫外线UV、α-MSH刺激等，从组成型表达的黑色素和诱导型表达的黑色素两个维度研究，对检测结果的信号窗口（Signal Window）也有很大影响。格宁生物可以根据客户需求定制方法或者参考国内团标的方法开展待测样品的美白功效的研究和验证。

总之，重建3D黑色素表皮模型是研究验证待测样品美白功效的有效工具之一，可实现化妆品原料及配方的体外科学检测并与临床评估结果保持一致性，不仅可以回答待测物是否有美白功效，还可以回答如何发挥美白功效等调节机制问题，并且具有检测周期短，成本低、可重现性好等优点。重建3D黑色素表皮模型在美白化妆品以及药物制剂对调节皮肤色素沉着的功效研发中得到广泛应用。